2012年4月12日 星期四 生命科学导论精品课程欢迎你!
分子生物学概论 -- PCR技术简介

 

 

 


 
前言
一滴残留在裙子上的精液使得美国总统 Bill Clinton 不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是 PCR(Polymerase chain reaction)-- 聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。
何谓 PCR
简单的说, PCR 就是利用 DNA 聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。基本上它是利用 DNA 聚合酶进行专一性的连锁复制 . 目前常用的技术 , 可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。
PCR 的要素
基本的 PCR 须具备1 . 要被复制的 DNA 模板 (Template) 2 . 界定复制范围两端的引物 ( Primers). 3 .DNA 聚合酶 (Taq. Polymearse) 4. 合成的原料及水。 PCR 的反应包括三个主要步骤,分别是 1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers 。 所谓 Denaturing 乃是将 DNA 加热变性, 将双股的 DNA 加热后转为单股 DNA 以做为复制的模板 . 而 Annealing 则是令 Primers 于一定的温度下附着于模板 DNA 两端。 最后在 DNA 聚合酶 (e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers) 及另一股的合成 。
PCR 的历史
PCR 的发展可以说是从 DNA 合成酵素的发现缘起。 DNA 合成酵素最早于 1955 年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的 Klenow fragment of E. Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr. H. Klenow 所发现 , 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素 , 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。现今所使用的酵素 ( 简称 Taq polymerase), 则是于 1976 年从热泉 Hot spring 中的细菌 (Thermus Aquaticus) 分离出来的。 它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酵素,但它被广泛运用则于 80 年代之后。 PCR 的原始雏形概念是类似基因修复复制 (DNA repair replication) ,它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表第一个单纯且短暂性基因复制 ( 类似 PCR 前两个周期反应 ) 的实验。 而现今所发展出来的 PCR 则于 1983 由 Dr. Kary B. Mullis 发展出的, Dr. Mullis 当年服务于一家物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation). 目前这家公司在 PCR 的相关仪器及原料上占有很大的?场。 Dr.Mullis 并于 1985 年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后, PCR 的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。在 1989 年, Science 将 PCR 中的 DNA 合成酵素命名为当年的风云分子 (Molecule of the year) ,而 PCR 本身则列为年度的重要科学发明产物。当然,它的原发明者更在往后获得诺贝尔的桂冠。
影响 PCR 的因素
PCR 是非常直接、简单又具有强大威力的技术。诚如一位当年参与 PCR 诞生的资深研究员 Henry Erlich 所言 ” 在分子生物学的领域中,只要拥有它,你便可以无照营业 ”(PCR allows people to practice molecular biology without a liscence) 。也因此,活用及慎用 PCR 是确保一定品质的必要条件。 PCR 本身虽然是一个单纯的实验技术,但是一个好的 PCR 反应及其产物则是受到很多因素的影响。这些因素色括反应中各种原料的浓度 (Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCl2…) ,也包括整个反应中各步骤的温度与时间的设定。当然 DNA 模板 (Template) 与 引信 (Primers) 本身条件也占有一定的重要性。近来的观念中,共溶剂诸如 Dimethyl sulfoxide (DSMO) 、 glycerol 、 Foramide and Tetramethylammonium chloride (TMAC) 也对整个反应产生若干重要的影响。
PCR 的运用
PCR 除了是一个诊断工具外,更重要的是它有广泛的运用。 PCR 本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否,也可以用来侦测基因是否有异常 (Gene mutation, deletion, and rearrangement…) 。例如,在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估; 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (DNA sequencing) 及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定,从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。 也可以做 DNA 指纹 (Fingerprints) 比对帮助亲子关系的鉴定。 PCR 更可以用于器官移植组织兼容性 HLA 的分析。另外在演化上的分析,经由 PCR 的运用也产生重大的进展。近来,在生物医学的研究上,特别是细胞间讯息的传递分子,诸如介白质 (Interleukines) 及各种生长因子 (Growth factors) 基因的表现都可用 PCR 来进行质与量的分析。
PCR 污染及解决对策
PCR 检测微量感染因子时,一定要注意产物残留污染的问题。
一. 污染的预防
进行 PCR 操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。

(一)划分操作区:目前,普通 PCR 尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行, PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:
1. 标本处理区,包括扩增摸板的制备;
2. PCR 扩增区,包括反应液的配制和 PCR 扩增;
3. 产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。
各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→ PCR 扩增→产物分析→产物处理。
切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。
(二)分装试剂: PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA :
1 . PCR 用水应为高压的双蒸水;
2 . 引物和 dNTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制;
3 . 引物和 dNTP 应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。
( 三 ) 实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:
1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;
2. 使用一次性吸头,严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;
3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;
4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将 dNTP 、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;
5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证 PCR 反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少 PCR 操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;
8. 重复实验,验证结果,慎下结论。

二. 追踪污染源
如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染。
(一)设立阴阳性对照:有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照, 100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重,因为 PCR 敏感性极高,可以从其它方法( Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外,每次扩增均应包括 PCR 体系中各试剂的时机对照,即包括 PCR 反应所需的全部成分,而不加模板 DNA ,这对监测试剂中 PCR 产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了。此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理。
(二)环境污染:在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染。
环境污染中常见的污染源主要有:
1. 模板提取时真空抽干装置;
2. 凝胶电泳加样器;
3. 电泳装置;
4. 紫外分析仪;
5. 切胶用刀或手术刀片;
6. 离心机;
7. 冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等;
此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。 1 )用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源; 2 ) 0.1ml 去离子水浸泡; 3 )取 5ml 做 PCR 实验; 4 )电泳检测结果。
8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中 PCR 产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物(与原引物无相关性)。
三.污染处理
(一)环境污染
1. 稀酸处理法:对可疑器具用 1mol/L 盐酸擦拭或浸泡,使残余 DNA 脱嘌呤;
2. 紫外照射( UV )法:紫外波长( nm )一般选择 254/300nm ,照射 30min 即可。需要注意的是,选择 UV 作为消除残留 PCR 产物污染时,要考虑 PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布, UV 照射仅对 500bp 以上长片段有效,对短片段效果不大。 UV 照射时, PCR 产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是 DNA 链中所有嘧啶均能形成二聚体,且 UV 照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于 UV 波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长 DNA 链上,形成二聚体缺陷的数量少于 0.065/ 碱基,其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇, DNA 链间与链内的交联和 DNA 断裂等)均可终止 Taq DNA 聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点( 0.13/ 碱基)在 DNA 分子上随机分布,一个 500bp 片段的 DNA 分子链上将有 32 处损伤位点,那么, 105 个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反,如果 100bp 的片段,每条链上仅有 6 处损伤, 105 个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是 UV 照射有一定的片段长度限制的原因。
(二)反应液污染
可采用下列方法之一处理:
1. DNase I 法: PCR 混合液(未加模板和 Taq 聚合酶)加入 0.5U DNase I ,室温反应 30 min 后加热灭活,然后加入模板和 Taq 聚合酶进行正常 PCR 扩增。该方法的优点是不需要知道污染 DNA 的序列;
2. 内切酶法:选择识别 4 个碱基的内切酶(如 Msp I 和 Taq I 等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用 1h 后加热灭活进行 PCR ;
3. 紫外照射法:未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述 UV 照射法;
4. g 射线辐射法: 1.5kGy 的辐射可完全破坏 0.1ng 基因组 DNA , 2.0 kGy 可破坏 104 拷贝的质粒分子, 4.0 kGy 仍不影响 PCR ,但高于此限度会使 PCR 扩增效率下降。引物可受照射而不影响 PCR , g 射线是通过水的离子化产生自由基来破坏 DNA 的。
(三)尿嘧啶糖苷酶( UNG )法
由于 UV 照射的去污染作用对 500bp 以下的片段效果不好,而临床用于检测的 PCR 扩增片段通常为 300bp 左右,因此 UNG 的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理:在 PCR 产物或引物中用 dU 代替 dT 。这种 dU 化的 PCR 产物与 UNG 一起孵育,因 UDG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N- 糖基键,可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。 UNG 对不含 dU 的模板无任何影响。 UNG 可从单或双链 DNA 中消除尿嘧啶,而对 RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP 法:用 dUTP 代替 dTTP ,使产物中掺入大量 dU 。在再次进行 PCR 扩增前,用 UNG 处理 PCR 混合液即可消除 PCR 产物的残留污染。由于 UNG 在 PCR 循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含 dU 的新的 PCR 产物。
3. dU 引物法:合成引物时以 dU 代 dT ,这样 PCR 产物中仅 5 ?端带 dU 。 UNG 处理后,引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段( 1-2kb 以上)的扩增用 dUTP 法效率较用 dTTP 低,而用 dU 法就可克服这一缺点。 dU 引物最好将 dU 设计在 3 ?端或近?端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点:可以去除任何来源的污染; UNG 处理可以和 PCR 扩增在同一个反应管内进行;由于扩增产物中有大量 dU 存在,可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入 dUTP 的 DNA 不应对产物的任何操作有影响,在进行 PCR 产物克隆时,应该转化 UNG- ( UNG 缺陷)大肠杆菌受体菌,否则转化产物会被受体菌 UNG 消化掉。
(四) 固相捕获法
用于去除标本中污染的核酸和杂质,原理如下: 1 )用一生物素标记的单链 RNA 探针与待扩核酸杂交,杂交区域是非扩增区; 2 )用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸,通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质; 3 )洗脱靶分子后用特异引物扩增非 RNA 探针杂交区域。第 2 )步的漂洗后可用 PCR 检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。
(五) RS-PCR 法( RNA-specific PCR )
也称为链特异性 PCR ,主要指用于 RNA 模板的特异性 PCR 法,该法可明显降低假阳性而不影响 PCR 的敏感性。其关键在于设计引物,逆转录引物的 3 ?端( A 区)有 2 0 个核苷酸左右为模板的特异性互不序列, 5 ?端 2 0 个核苷酸( C 区)为附加修饰碱基。与 mRNA 逆转录后,经超速离心使 cDNA 与多余引物分开,再用和第二引物( C )以第一链 cDNA 为模板合成第二链 cDNA ,以后的 PCR 循环中用逆转录引物的 B 区和引物 C 进行扩增加尾 cDNA ,而污染的 DNA 或质粒 DNA 才不会被扩增。
(六)抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒 DNA 克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中,在重组质粒中,这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本,也不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒 DNA 才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。
四.其它 PCR 检测方法:
(一) 两步法:
是指在用套式 PCR 方法扩增某些含量低微的标本时,两对引物在同一个管中以简化步骤,减少污染。通常第一步进行 20-25 个循环,扩增外引物片段;第二步再进行 10 个循环,扩增内引物片段。两步法对内外引物的 Tm 值有特殊要求,即内外引物的退火温度高(如 68 ℃),在此温度下内引物不与模板退火,然后降低退火温度(至 55 ℃)再扩增内引物片段,这样,在操作过程中,仅打开 PCR 反应管一次,大大减少了污染的可能性。
(二) 荧光法:亦称荧光 PCR 技术( fluoresence PCR, F-PCR ),是 1995 年由美国 PE 公司首先研制成功的,它融汇了 PCR 的灵敏性、 DNA 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点,电脑同步跟踪,数据自动化处理,直接探测 PCR 过程中的变化以获得定量的结果,不需要做 PCR 后处理或检测,完全闭管操作。探针标记除用 TET 和 FAM 外,还可用 HEX 、 JOE 作为报告荧光, 3 ′端的淬灭基团常用 TAMRA 。在探针保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在探针被切断后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与 PCR 产物的数量呈正比。荧光检测仪器透过 PCR 管壁能直接检测到荧光信号的波长和长度变化。
主要有以下优点:
1. 探针特异性强,假阳性率低;
2. 操作快速,不需要 PCR 后处理;
3. 定量范围宽, HBV 0.4fg-4000fg/ml(102-106 Dane ′ s particle/ml) ;
4. 闭管操作, PCR 产物污染少;
5. 灵敏度高。
主要方法有:
1.. 荧光探针法:进行荧光 PCR 检测时,要求荧光探针必须完全与靶基因互补,长度以 20-30 个碱基为宜,必要时 3 ′端磷酸化封闭,以防在扩增时作为引物延伸。该方法利用 Taq 酶的 3 ′→ 5 ′聚合酶活性及 5 ′→ 3 ′外切酶活性,可以在链延伸过程中实现链替换,并将被替换的探针切断,故可进行定性与定量检测。
荧光探针 5 ′端标记的 TAMRA ,在 480nm 激发下产生 530nm 的红色荧光; 3 ′端标记的 FAM ,激发后产生绿色荧光。 PE 公司推出的 TaqMan 系统,即采用双荧光探针,如配合使用 PCR 扩增与荧光检测合二为一的仪器,可进行实时( real-time )定量检测。

2 .分子信标法:分子信标( molecular beacon )是一个发夹样结构的特异探针,其环状部分与靶序列互补。在室温时,分子信标的发夹紧闭,荧光淬灭。 PCR 扩增时,随着温度升高,发夹松开,与单链模板特异结合,发出荧光。荧光强度与模板呈正比,故可用于 PCR 产物的定性及定量。
总之,人类在迈入廿一世纪中即将出现若干的突破,生物医学便是其中重要的一项。在过去三、四十年耒,像 PCR 这样影响深远的技术实在很难找到。它的震撼 , 除了众多的得奖外 ( 包括诺贝尔奖 ), 更在于它的可塑性、修饰性及全方位的运用。未来的生物医学领域中,它也必定继续扮演举足轻重的角色。
 
参考资料
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