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植物组织细胞培养

   植物组织培养( Plant tissue culture )技术,是 20 世纪兴起的一项植物细胞工程技术。它的基本内容是:从外界植物体上取下任意的一个到几个细胞或者一块组织在全人工的离体条件下进行培养,经过细胞或者组织的分裂、分化及几何增殖达到植株的形态重建和快速繁殖的目的。

    植物细胞具有全能性,即任何一个植物细胞都具有形成该植物体的能力。换言之,任何一个高度分化的细胞都具有回复到原始未分化细胞的能力,并且能分化为其他形式的高分化细胞。 ` 这种 “ 全能性 ” 就是植物组织培养的理论基础。我们依据植物细胞的这种特性,可以任意的使植物体的任何一个高分化的细胞经过脱分化培养( Dedifferentiation culture ) , 形成原始干细胞团,或者称之为愈伤组织( Cellus ),将得到的愈伤组织经过一定的的培养途径,这种低分化细胞开始分化,逐步形成各种高分化细胞,这个过程称为植物细胞的再分化( Redifferentiation )。再分化后的植物细胞即可形成宏观形态上的芽和根,至此该种植物的离体繁殖系宣告建成。

    将得到的该种植物的离体繁殖系经过反复的分离和微扦插,即可达到几何数级的增殖,此过程就是所谓的快速微繁殖或者快速繁殖( Rapid propagation )。植物快速繁殖通常是在离体繁殖系建成之后进行,有时也可以将愈伤组织进行快速增殖,此时通常采用液体悬浮培养。

    若该种植物能形成球状胚体( Embryois ),则又常常把快速繁殖阶段选定在球胚的增殖。总之,只要能达到快速繁殖的目的,用作快繁的阶段可以随意选择。

    植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。习惯上我们经常使用化学药剂处理,例如氯化汞、次氯酸盐或者抗生素等。将从母株上取下的组织进行一定的剥离和分割,经过流水冲洗数分钟,再浸入适宜浓度的化学药剂中一段时间,最后经无菌水冲洗并适当分割即成外植体。制备外植体的原则是无菌和有活性,无菌是外植体植被的要求,有杂菌带入培养基会造成微生物污染,而阻滞甚至杀死外植体。有活性是外植体制备的前提,无活性的外植体的培养在植物组织培养中是无意义的。

    无菌操作是贯穿于整个组织培养过程的一门关键技术,甚至可以说组织培养的前提就是无菌。事实上外植体的制备过程就是无菌处理过程,而其后的一系列操作都是在无菌环境下进行的,实验室中经常使用的无菌操作设备是超净工作台。超净工作台通常借助紫外光结合逆压渗透的超滤风技术来满足无菌要求。无菌操作者的操作手法和习惯也是无菌操作成功与否的关键,通常进行无菌操作的实验人员也要经过严密的无菌操作训练并建立严格的 “ 无菌概念 ” 。

    能否把植物组织培养做到满意的人工调控,关键在于人工培养环境。人工培养环境是整个组织培养的难点和重点,也是近百年来植物生理学家一直探讨和研究的重要话题。人工培养环境包括能量的来源 —— 光照,新陈代谢的保证 —— 温度,气 - 水平衡 —— 湿度,生物原料的来源 —— 培养基。这与植物的自然环境是类似的,即光照、温湿度和土壤。光照、温度的选定通常依据所培养植物的生态习性,习惯上采用暗培养与光照培养 (8h/d,3000lx) 的结合,温度在 25-28 度。湿度在组织培养中不需特意的调整,因为培养容器中的湿度几乎达到

    100%. 如此说来,人工培养环境的重难点自然而然地落在了培养基上。

    培养基 (Culture medium) 是从无土栽培的营养液发展而来的,在某种意义上说就是模拟土壤。最初的培养基就是简单的马铃薯浸出液即土豆汁。后来随着植物生理学和生物化学的研究的深入,培养基越来越复杂,成分越来越多。当支持物 ( 如:琼脂、明胶 ) 的发现并且应用到培养基的培养基中时,固体培养基随之诞生。固体培养基是组织培养基中最常用的一种培养基的类型。人工合成培养基通常包括大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、支持物和植物激素。大量元素和微量元素通常使用无机盐代替,铁盐通常以螯合铁的形式出现,

    有机复合物通常包括氨基酸、代谢载体和维生素等,糖可采用蔗糖或者葡萄糖,支持物一般采用高分子交联糖链 ( 如聚半乳糖硫酸酯 ) ,这几类物质的用量和配比在多少年的发展中已经基本上形成了若干个模板,例如实验室中常用的 MS 、 B5 、 Nicher 培养基。

    植物激素,是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素,也是人工调控组织培养的 “ 魔术棒 ” 。几乎所有的植物组织培养工作者都认同植物激素在组织培养中具有无可动摇的核心地位。植物激素包括五大类:生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中很重要,即所谓的 “ 激素杠杆 ” 。例如:生长素生物学效应高于细胞分裂素时,诱导植物组织脱分化和根原基的形成;细胞分裂素的效应高于生长素时,诱导植物组织再分化和芽原基的形成。生长素包括很多种,如 1- 奈乙酸、吲哚乙酸和 2 , 4-D 等,它们的生物学效应有着微妙的不同,但总体效应是一致的。细胞分类素也是如此,包括 6- 苄基腺嘌呤、 6- 糠氨基嘌呤和玉米素等。植物激素在培养基中的用量通常在 0.01-10mg/L(ppm).

    之间变化,细胞分裂素的浓度在非生根培养中要大于生长素。值得指出的是,植物激素的用量要考虑组织内源激素的含量及其生理学周期效应。换言之,激素的生物学效应是组织内源激素和人工添加的外源激素效应的总和。只有准确把握内源激素与外源激素的协同作用,才能有效地操作 “ 激素杠杆 ” ,用好植物激素这根 “ 魔术棒 ” ,做好植物组织培养。

    当应用组织培养技术建成了某种植物的整体形态,即得到了有茎、根、叶的苗子,要经历一定的炼苗处理,使之逐步由无菌环境到有菌环境,由人工培养环境过渡到自然环境。习惯上是采用 “ 过渡处理法 ” ,即逐渐地使环境改变,如出瓶苗要使用消毒的土壤、保湿、保温,同时还要做一定的壮苗处理,如增加光照和补充营养液等。经过一系列的处理,一株组织培养出来的 “ 克隆苗 ” 就顺利成活了。

    植物组织培养技术,是植物细胞工程学、遗传学、植物生理学、生物化学与分子生物学研究的重要基本技术。也就是说,植物组织培养技术不仅仅用于快速繁殖,而是有着相当广泛的用途。例如:单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等等。近年来 ,组织培养技术日趋完善,但仍然存在很大的不足和有待改善的方面,这就需要广大的科学工作者和组织培养的爱好者的共同努力。目前,组培快繁技术在兰花等观赏花卉中基本实现了工厂化育苗,由此可见其应用前景的光明。考虑到技术与产业之间的距离,切忌盲目建立大规模的组织培养室,在某一种植物工厂化育苗系统的建立之前一定要充分审视各相关要素,权衡利弊后再行建设,以减少无谓的投入。

 

 

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