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RNA干涉(RNA Interference,RNAi)

 

RNA干涉-RNA Interference,RNAi

  基因沉默(gene silencing)是生物体内特定基因由于种种原因不表达的遗传现象。一方面,基因沉默是生物遗传操作创造新的遗传修饰生物(genetically modified organisms)的障碍,另一方面,它又是植物抵抗外来核酸入侵(如病毒)的一种反应,为植物抗病毒 的遗传育种提供了具有实用价值的策略:RNA 介导的病毒抗性(RNA mediated virus resistance, RMVR)。近年来,在不同的研究领域和生物中发现了许多新的使基因关闭或沉默的类型,并赋予其不同的名称:在植物中称为RNA 共抑制(co-suppression),在真菌中叫RNA 压制(quelling),动物中则叫RNA干涉(interference)。RNA干涉是指短的dsRNA 可以降解内源的同源RNA,,而使相应基因沉默的现象,简称RNAi。

1995 年,康乃尔大学 Su Guo 博士,于试图阻断线虫( C. elegans )中 par-1 基因时,发现了一个意想不到的现象:她们本来利用 anti-sense RNA 技术,可达到特异性阻断 par-1 基因的表达,同时亦在其对照组实验中,注射 sense RNA 到线虫体内,预期可能观察到此基因表现的增强。但得到的结果竟是二者都切断了 par-1 基因的表达途径。这与传统上对 anti-sense RNA 技术的解释竟是正好相反。研究小组一直没能把这个意外结果予以合理的解释。

直到 1998 年 2 月,华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学医学院的 Craig Mello 才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作,他们证实, Su Guo 博士遇到的 sense RNA 抑制基因表达的现象,以及过去的 anti sense RNA 技术对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得 RNA 中污染了微量双链 RNA 而引起。当他们将体外转录得到的单链 RNA 纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链 RNA 却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为 RNA 干扰( RNA interference , 简称 RNAi )。

随后,在短短一年中, RNAi 现象被广泛地发现于真菌、阿拉伯芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等多数真核生物中。这种存在机制揭示了 RNAi 很可能出现在生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入, RNAi 的机制正逐步地被阐明,同时亦成为功能基因组研究领域中的有力工具, RNAi 也越来越为人们所重视。

体外实验表明: RNAi 反应中,加入的 双股 ds RNA 可切割出 21-23 核苷酸长度的 RNA 片段,后者会使 target mRNA 被切割为 21-23 核苷酸长的片段。从已经发生 RNAi 的果蝇 S2 细胞中, Hammond 等人纯化出一种具有序列特异性的核酸酶,它仅会降解与引起 RNAi 的 dsRNA 具有同源序列的 mRNA 。那么这种核酸酶如何确定哪些 mRNA 该降解,而哪些不该呢?由于在纯化该核酸酶时,共分离出 21-23 核苷酸的 dsRNA 片段,暗示着该核酸酶对 mRNA 的切割,可能是以这些片段作为模板来指导核酸酶进行切割程序。

根 据 以上的实验结果,研究人员提出一种 RNAi 作用的简单模型 :当 ds RNA 导入细胞后,可被一种 ds RNA 特异的核酸内切酶识别,切割成 21-23 核苷酸的小片段,这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域作结合,并且作为模板来辨识 target mRNA;识别之后,此 mRNA 与 dsRNA sense chain 发生链互换,原先 dsRNA 中的 sense chain 被 mRNA 取替,而从 enzyme-dsRNA complex 中释放出来,而 mRNA 则位于原先 sense chain 的位置。同时此核酸酶亦在同样位置对 mRNA进行切割,这样又产生了21-23核苷酸长的 dsRNA小片段,再度与核酸酶形成复合物,继续对target mRNA 进行切割,从而使目的基因沉默,无法作用进而产生 RNAi 的现象。在使用遗传分析的方法后,目前从线虫中已分离到 RDE-2, RDE-3和 Mut-7等 RNAi 相关的基因 。

R NAi 在功能基因组的研究中,可作为一种强有力的工具。我们将功能未知的基因编码区,如外显子- exon 或启动子 - promoter 区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达效能。如此在转殖基因个体内转录出的RNA,即可形成 dsRNA,产生RNA干涉,使目的基因沉默,从而进一步研究目的基因的功能,这种技术即为 RNAi 技术。根据所选用序列的不同,可将其分为编码区RNAi 和启动子区 RNAi 技术。

1 .编码区RNAi技术
自1998年在线虫中发现 RNAi 现象以来,以基因编码区为标的序列的编码区 RNAi 技术已广泛用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达,产生突变表型,但这种表型变化却不能遗传。

早期的 RNAi 技术可用在研究与胚胎发育相关基因的功能上,但是由于细胞分裂造成 dsRNA 的稀释,使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。为弥补早期 RNAi 技术的不足,Tavernarakis 等将 RNAi 技术做了一些改进及更动,将目的基因之标的序列以反向重复的方式,由热激启动子来控制此基因在生物体中表达程度。经过热休克的处理后,反向重复序列即在细胞内开始转录,其产物会形成具发夹环结构的dsRNA,从而产生 RNAi,使目的基因沉默。

这种改进的 RNAi 技术与传统的 RNAi 技术相比,具有明显的优点:首先转殖基因可以遗传给后代,有利于突变的分析;其次dsRNA可以被诱导产生,RNAi能够在发育特定阶段出现,从而使不可能出现在发育晚期的早期基因功能,进而可以研究早期发育必需基因在晚期的基因功能。另外,使用细胞特异性启动子来控制 dsRNA 的表达时,可以同时研究特定基因在不同器官中的功能。Kennerdell J. R.和CarthewR. W.已使用 GAL4/UAS 系统控制 dsRNA 在果蝇中的表达,实现了诱导性或细胞特异性控制RNAi 的发生。

随着应用 RNAi 技术研究线虫功能基因组工作的开展,研究人员对该技术在植物中应用亦开始探索其可能性。加州理工大学的 Chuang C. F.和Megerowitz E. M.使用此技术研究"拟南芥"的 AG, CLV3, AP1, PAN 四个与开花相关的基因。结果表明:使用RNAi 技术可以产生功能丧失或降低突变体,而其表型与以前使用其它方法鉴定之突变体类似。使用 RNA 原位杂交方式可表明,在 RNAi 突变体的 target mRNA 显著降低。该结果说明 RNAi 技术亦可以成为植物功能基因组研究中的有力工具。

2 .启动子区 RNAi 技术
M. F. Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成 21-23核苷酸长的片段,这种 dsRNA可使内源性相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。

由于多基因家族的各成员之间具有高度的同源性,因而使用编码区 RNAi 技术很难将各个成员区分开来研究,而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大,因此若采用启动子区 RNAi 技术,则有希望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区 RNAi 技术和启动子区 RNAi 技术的信息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。

RNAi 现象存在的广泛性远远超过人们的预期,对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力左证。而与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比, RNAi 技术具有明显的优点,它比反义 RNA 技术和同源共抑制更有效,更容易产生功能丧失或降低突变。而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统的结合使用,可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行,再与 T-DNA 技术造成的功能永久性缺失相比较,则这个 RNAi 的实验技术则是更受科学家所偏爱的。由于科学家们的努力工作,一个崭新的 RNA 时代呼之欲出。

RNA interference (RNAi) refers to the post-transcriptional silencing of gene expression due to the presence of double stranded RNA (dsRNA). This phenomenon was first described in plants in the early 1990's when it was discovered that the introduction of an extra copy of an endogenous gene led to the degradation of both the introduced and endogenous gene transcripts (Vaucheret et. al., Post-transcriptional gene silencing in plants, J.Cell Science, 2001 Sep; 114 (pt 17):3083-91). In plants, this peculiar behavior was called “co-suppression”. Soon, similar findings were seen in the fungus Neurospora crassa , where it was termed “quelling”. In 1998, Fire et. al., demonstrated that the introduction of dsRNA into the nematode Caenorhabditis elegans interfered with gene expression in a sequence specific manner (Fire et. al., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature, 1998 Feb 19; 391(6669):806-11). The term for this phenomenon became “RNA interference” or “RNAi”.

 

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